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第三章 細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法
第一節(jié) 培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)
一、基本概念通常,體外培養(yǎng)的生物成分無外乎兩種結(jié)構(gòu)形式:
其一是小塊組織或稱為組織塊(tissue block),一般稱為外植塊;
其二是將生物組織分散后制成的單個(gè)細(xì)胞,一般稱為分離的細(xì)胞(isolated cell)或者分散的細(xì)胞(dissociated cell)。
分散的過程通常在培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中進(jìn)行,分散的細(xì)胞被懸浮于培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中。
單個(gè)細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中,就稱為細(xì)胞懸液(cell suspension)。
狹義的細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)主要是指分離(散)細(xì)胞培養(yǎng),廣義的細(xì)胞培養(yǎng)的概念還包括單(個(gè))細(xì)胞培養(yǎng)(single cell culture)。一種是群體培養(yǎng)(mass culture),將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中,讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),匯合(confluence)后形成均勻的單細(xì)胞層;另一種是克隆培養(yǎng)(clonal culture),將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,各個(gè)細(xì)胞貼壁后,彼此距離較遠(yuǎn),經(jīng)過生長(zhǎng)增殖每一個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)細(xì)胞集落,稱為克?。╟lone)。一個(gè)細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個(gè)祖先細(xì)胞。
現(xiàn)今,用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基本有3類,即原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞株及傳代細(xì)胞系。經(jīng)過幾十年的研究和發(fā)展,目前我國(guó)已經(jīng)擁有了可以進(jìn)行大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的動(dòng)物原代細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和Vero細(xì)胞等生產(chǎn)技術(shù),用于生產(chǎn)多種人用、動(dòng)物疫苗。其中二倍體細(xì)胞(如我國(guó)70年代建立的人胚肺二倍體細(xì)胞株KMB17和2BS)對(duì)多種病毒具有廣泛的敏感性,用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細(xì)胞時(shí)在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的危險(xiǎn),是當(dāng)前病毒性疫苗生產(chǎn)較為理想的細(xì)胞基質(zhì)。Vero細(xì)胞是1962年由日本Chiba大學(xué)的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的,是一種貼壁依賴性成纖維細(xì)胞,核型為2n 60,高倍體率約為1.7%,可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng),不含任何污染因子。通常使用199培養(yǎng)基添加5%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。該細(xì)胞可用于多種病毒的增殖,已被WHO批準(zhǔn)廣泛用于人用、動(dòng)物用疫苗生產(chǎn)。
二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型
(一)貼附型:大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng),屬于貼壁依賴性細(xì)胞,大致分成以下四型:
1、成纖維細(xì)胞型:胞體呈梭型或不規(guī)則三角形,中央有卵圓形核,胞質(zhì)突起,生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外,凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織,如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。
2、上皮型細(xì)胞:細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形,中央有圓形核,細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng),處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連,很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。
3、游走細(xì)胞型:呈散在生長(zhǎng),一般不連成片,胞質(zhì)常突起,呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng),方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定,有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。
4、多型細(xì)胞型:有一些細(xì)胞,如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài),可統(tǒng)歸于此類。
(二)懸浮型:見于少數(shù)特殊的細(xì)胞,如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形,不貼于支持物上,呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖。
三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程:體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中,而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器,生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后,則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營(yíng)養(yǎng)液,否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存,這一過程叫傳代(Passage或Subculture)。每次傳代以后,細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過程都會(huì)受一定的影響。另外,很多細(xì)胞在體外的生存也不是無限的,存在著一個(gè)發(fā)展過程。所有這一切,使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點(diǎn)。
(一)培養(yǎng)細(xì)胞生命期(Life Span of Culture Cells):所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期,是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng),在不凍存和反復(fù)傳代條件下,可傳30~50代,相當(dāng)于150~300個(gè)細(xì)胞增殖周期,能維待一年左右的生存時(shí)間,最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個(gè)體,則生存時(shí)間較短;如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞,如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞,生存時(shí)間更短,僅能傳幾代或十幾代。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變,如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí),細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何,在細(xì)胞全生存過程中,大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段:
1、原代培養(yǎng)(Primary Culture)期:也稱初代培養(yǎng),即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段,一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng),可見細(xì)胞分裂,但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的(Heterogeneous),也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同,細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。
2、傳代期:初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下,細(xì)胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型,呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系(Diploid Cell Line)。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì),細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存,則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度,以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10~50次左右,細(xì)胞增殖逐漸緩慢,以至完全停止,細(xì)胞進(jìn)入第三期。
3、衰退期:此期細(xì)胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng),最后衰退凋亡。
在細(xì)胞生命期階段,少數(shù)情況下,在以上三期任何一點(diǎn)(多發(fā)生在傳代末或衰退期),由于某種因素的影響,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(Spontaneous Transformation)。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細(xì)胞永生性也稱不死性,即細(xì)胞獲持久性增殖能力,這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系(Infinite Cell Line),也稱連續(xù)細(xì)胞系(Continuous Cell Line)。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末,或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后,核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā),轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。
(二)組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所有體外培養(yǎng)細(xì)胞,包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系,當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下,細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對(duì)要快(實(shí)際上細(xì)胞接種數(shù)量大