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細胞培養實(shí)驗技術(shù)大全(二)

 二維碼 286
2016-11-15 細胞之邦


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第三章 細胞培養的基本方法
第一節 培養細胞的細胞生物學(xué)
一、基本概念通常,體外培養的生物成分無(wú)外乎兩種結構形式:
其一是小塊組織或稱(chēng)為組織塊(tissue block),一般稱(chēng)為外植塊;
其二是將生物組織分散后制成的單個(gè)細胞,一般稱(chēng)為分離的細胞(isolated cell)或者分散的細胞(dissociated cell)。
分散的過(guò)程通常在培養液或平衡鹽溶液中進(jìn)行,分散的細胞被懸浮于培養液或平衡鹽溶液中。
單個(gè)細胞分散存在于培養液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中,就稱(chēng)為細胞懸液(cell suspension)。
狹義的細胞培養(cell culture)主要是指分離(散)細胞培養,廣義的細胞培養的概念還包括單(個(gè))細胞培養(single cell culture)。一種是群體培養(mass culture),將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中,讓細胞貼壁生長(cháng),匯合(confluence)后形成均勻的單細胞層;另一種是克隆培養(clonal culture),將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養瓶中,各個(gè)細胞貼壁后,彼此距離較遠,經(jīng)過(guò)生長(cháng)增殖每一個(gè)細胞形成一個(gè)細胞集落,稱(chēng)為克?。╟lone)。一個(gè)細胞克隆中的所有細胞均來(lái)源于同一個(gè)祖先細胞。
現今,用于疫苗生產(chǎn)的細胞基本有3類(lèi),即原代細胞、二倍體細胞株及傳代細胞系。經(jīng)過(guò)幾十年的研究和發(fā)展,目前我國已經(jīng)擁有了可以進(jìn)行大規模疫苗生產(chǎn)的動(dòng)物原代細胞、二倍體細胞和Vero細胞等生產(chǎn)技術(shù),用于生產(chǎn)多種人用、動(dòng)物疫苗。其中二倍體細胞(如我國70年代建立的人胚肺二倍體細胞株KMB17和2BS)對多種病毒具有廣泛的敏感性,用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細胞時(shí)在其培養物中可能存在的各種潛在致病因子的危險,是當前病毒性疫苗生產(chǎn)較為理想的細胞基質(zhì)。Vero細胞是1962年由日本Chiba大學(xué)的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的,是一種貼壁依賴(lài)性成纖維細胞,核型為2n 60,高倍體率約為1.7%,可持續地進(jìn)行培養,不含任何污染因子。通常使用199培養基添加5%胎牛血清進(jìn)行培養。該細胞可用于多種病毒的增殖,已被WHO批準廣泛用于人用、動(dòng)物用疫苗生產(chǎn)。
二、體外培養細胞的分型
(一)貼附型:大多數培養細胞貼附生長(cháng),屬于貼壁依賴(lài)性細胞,大致分成以下四型:
1、成纖維細胞型:胞體呈梭型或不規則三角形,中央有卵圓形核,胞質(zhì)突起,生長(cháng)時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細胞外,凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織,如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內皮等常呈本型狀態(tài)。培養中細胞的形態(tài)與成纖維類(lèi)似時(shí)皆可稱(chēng)之為成纖維細胞。
2、上皮型細胞:細胞呈扁平不規則多角形,中央有圓形核,細胞彼此緊密相連成單層膜。生長(cháng)時(shí)呈膜狀移動(dòng),處于膜邊緣的細胞總與膜相連,很少單獨行動(dòng)。起源于內、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。
3、游走細胞型:呈散在生長(cháng),一般不連成片,胞質(zhì)常突起,呈活躍游走或變形運動(dòng),方向不規則。此型細胞不穩定,有時(shí)難以和其他細胞相區別。
4、多型細胞型:有一些細胞,如神經(jīng)細胞難以確定其規律和穩定的形態(tài),可統歸于此類(lèi)。
(二)懸浮型:見(jiàn)于少數特殊的細胞,如某些類(lèi)型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形,不貼于支持物上,呈懸浮生長(cháng)。這類(lèi)細胞容易大量繁殖。
三、培養細胞的生長(cháng)和增殖過(guò)程:體內細胞生長(cháng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中,而組織培養細胞的生存環(huán)境是培養瓶、皿或其它容器,生存空間和營(yíng)養是有限的。當細胞增殖達到一定密度后,則需要分離出一部分細胞和更新?tīng)I養液,否則將影響細胞的繼續生存,這一過(guò)程叫傳代(Passage或Subculture)。每次傳代以后,細胞的生長(cháng)和增殖過(guò)程都會(huì )受一定的影響。另外,很多細胞在體外的生存也不是無(wú)限的,存在著(zhù)一個(gè)發(fā)展過(guò)程。所有這一切,使組織細胞在培養中有著(zhù)一系列與體內不同的生存特點(diǎn)。
(一)培養細胞生命期(Life Span of Culture Cells):所謂培養細胞生命期,是指細胞在培養中持續增殖和生長(cháng)的時(shí)間。體內組織細胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。人胚二倍體成纖維細胞培養,在不凍存和反復傳代條件下,可傳30~50代,相當于150~300個(gè)細胞增殖周期,能維待一年左右的生存時(shí)間,最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個(gè)體,則生存時(shí)間較短;如培養的為其它細胞,如肝細胞或腎細胞,生存時(shí)間更短,僅能傳幾代或十幾代。只有當細胞發(fā)生遺傳性改變,如獲永生性或惡性轉化時(shí),細胞的生存期才可能發(fā)生改變。正常細胞培養時(shí),不論細胞的種類(lèi)和供體的年齡如何,在細胞全生存過(guò)程中,大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段:
1、原代培養(Primary Culture)期:也稱(chēng)初代培養,即從體內取出組織接種培養到第一次傳代階段,一般持續1一4周。此期細胞呈活躍的移動(dòng),可見(jiàn)細胞分裂,但不旺盛。初代培養細胞與體內原組織在形態(tài)結構和功能活動(dòng)上相似性大。細胞群是異質(zhì)的(Heterogeneous),也即各細胞的遺傳性狀互不相同,細胞相互依存性強。
2、傳代期:初代培養細胞一經(jīng)傳代后便改稱(chēng)做細胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持續時(shí)間最長(cháng)。在培養條件較好情況下,細胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型,呈二倍體核型的細胞稱(chēng)二倍體細胞系(Diploid Cell Line)。為保持二倍體細胞性質(zhì),細胞應在初代培養期或傳代后早期凍存。當前世界上常用細胞均在不出十代內凍存。如不凍存,則需反復傳代以維持細胞的適宜密度,以利于生存。但這樣就有可能導致細胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉化。一般情況下當傳代10~50次左右,細胞增殖逐漸緩慢,以至完全停止,細胞進(jìn)入第三期。
3、衰退期:此期細胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;細胞形態(tài)輪廓增強,最后衰退凋亡。
在細胞生命期階段,少數情況下,在以上三期任何一點(diǎn)(多發(fā)生在傳代末或衰退期),由于某種因素的影響,細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化(Spontaneous Transformation)。轉化的標志之一是細胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細胞永生性也稱(chēng)不死性,即細胞獲持久性增殖能力,這樣的細胞群體稱(chēng)無(wú)限細胞系(Infinite Cell Line),也稱(chēng)連續細胞系(Continuous Cell Line)。無(wú)限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末,或第三期初階段。細胞獲不死性后,核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細胞轉化亦可用人工方法誘發(fā),轉化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。細胞永生性和惡性性非同一性狀。
(二)組織培養細胞一代生存期 所有體外培養細胞,包括初代培養及各種細胞系,當生長(cháng)達到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養液的性質(zhì)、接種細胞數量和細胞增殖速度等有關(guān)。接種細胞數量大、細胞基數大、相同增殖速度條件下,細胞數量增加與飽和速度相對要快(實(shí)際上細胞接種數量大時(shí)細胞增殖速度比稀少時(shí)要快)。連續細胞系和腫瘤細胞系比初代培養細胞增殖快,培養液中血清含量多時(shí)細胞增殖比少時(shí)快。以上情況都會(huì )縮短傳代時(shí)間。
所謂細胞“一代”一詞,系僅指從細胞接種到分離再培養時(shí)的一段時(shí)間,這已成為培養工作中的一種習慣說(shuō)法,它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞,即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代(Generation)或倍增〔Doubling〕不同;在細胞一代中,細胞能倍增3~6次。
細胞傳一代后,一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段:
1、潛伏期(Latent Phase):細胞接種培養后,先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細胞胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。接著(zhù)是細胞附著(zhù)或貼附于底物表面上,稱(chēng)貼壁,懸浮期結束。各種細胞貼附速度不同,這與細胞的種類(lèi)、培養基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養細胞貼附慢,可長(cháng)達10~24小時(shí)或更多;連續細胞系和惡性細胞系快,10~30分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個(gè)非常復雜和與多種因素相關(guān)的過(guò)程。支持物能影響細胞的貼附;底物表面不潔不利貼附,底物表面帶有陽(yáng)性電荷利于貼附。另外在貼附過(guò)程中,有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素(Fibronectin),又稱(chēng)LETS(Larger External Transformation Substance),細胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也參與貼附過(guò)程。這些物質(zhì)都是蛋白類(lèi)成分,它們有的存在于細胞膜的表面(如CSP),有的則來(lái)自培養基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類(lèi)細胞生長(cháng)增殖條件之一。
細胞貼附于支持物后,除先經(jīng)過(guò)前述延展過(guò)程變成極性細胞,還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段,才進(jìn)入生長(cháng)和增殖期。細胞處在潛伏期時(shí),可有運動(dòng)活動(dòng),基本無(wú)增殖,少見(jiàn)分裂相。細胞潛伏期與細胞接種密度、細胞種類(lèi)和培養基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養細胞潛伏期長(cháng),約24~96小時(shí)或更長(cháng),連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短,僅6~24小時(shí);細胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當細胞分裂相開(kāi)始出現并逐漸增多時(shí),標志細胞已進(jìn)入指數增生期。
2、指數增生期(Logarithmic growth Phase):這是細胞增值最旺盛的階段,細胞分裂相增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長(cháng)旺盛與否的一個(gè)重要標志。一般以細胞分裂(Mitotic Index:MI)表示,即細胞群中每1000個(gè)細胞中的分裂相數。體外培養細胞分裂指數受細胞種類(lèi)、培養液成分、pH、培養箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數介于0.1%~0.5%,初代細胞分裂指數低,連續細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%~5%。pH和培養液血清含量變動(dòng)對細胞分裂指數有很大影響。指數增生期是細胞一代中活力最好的時(shí)期,因此是進(jìn)行各種實(shí)驗最好的和最主要的階段。在接種細胞數量適宜情況下,指數增生期持續3~5天后,隨細胞數量不斷增多、生長(cháng)空間漸趨減少、最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后,如培養的是正常細胞,由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動(dòng),這種現象稱(chēng)接觸抑制(Contact Inhibition)。而惡性細胞則無(wú)接觸抑制現象,因此接觸抑制可作為區別正常與癌細胞標志之一。腫瘤細胞由于無(wú)接觸抑制能繼續移動(dòng)和增殖,導致細胞向三維空間擴展,使細胞發(fā)生堆積(Piled up)。細胞接觸匯合成片后,雖發(fā)生接觸抑制,只要營(yíng)養充分,細胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂,因此細胞數量仍在增多。但當細胞密度進(jìn)一步增大,培養液中營(yíng)養成分減少,代謝產(chǎn)物增多時(shí),細胞因營(yíng)養的枯竭和代謝物的影響,則發(fā)生密度抑制(Density Inhibition),導致細胞分裂停止。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念,不應混淆。
3、停滯期(Stagnate Phase):細胞數量達飽和密度后,細胞遂停止增殖,進(jìn)入停滯期。此時(shí)細胞數量不再增加,故也稱(chēng)平頂期(Plateau)。停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動(dòng),繼而培養液中營(yíng)養漸趨耗盡,代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養即傳代,否則細胞會(huì )中毒,發(fā)生形態(tài)改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應越早越好。傳代過(guò)晚(已有中毒跡象)能影響下一代細胞的機能狀態(tài)。在這種情況下,雖進(jìn)行了傳代,因細胞已受損,需要恢復,至少還要再傳1~2兩代,通過(guò)換液淘汰掉死細胞和使受損輕微的細胞得以恢復后,才能再用。結果反而耽誤了時(shí)間,這是在實(shí)驗中應特別注意的。
四、原代培養:即第一次培養,是指將培養物放置在體外生長(cháng)環(huán)境中持續培養,中途不分割培養物的培養過(guò)程。有幾方面含義:
培養物一經(jīng)接種到培養器皿(瓶)中就不在分割,任其生長(cháng)繁殖;
原代培養中的“代”并非細胞的“代”數,因為培養過(guò)程中細胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細胞;
原代培養過(guò)程中不分割培養物不等于不更換培養液,也不等于不更換培養器皿。
正常細胞培養的世代數有限,只有癌細胞和發(fā)生轉化的細胞才能無(wú)限生長(cháng)下去。所謂轉化即是指正常細胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細胞。目前世界上許多實(shí)驗室所廣泛傳用的HeLa細胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培養而成。此細胞系一直延用至今。
原代培養的細胞一般傳至10代左右就不易傳下去了,細胞的生長(cháng)就會(huì )出現停滯,大部分細胞衰老死亡。但是有極少數的細胞能夠度過(guò)“危機”而繼續傳下去,這些存活的細胞一般能夠傳到40~50代,這種傳代細胞叫做細胞株。細胞株的遺傳物質(zhì)沒(méi)有發(fā)生改變,在培養過(guò)程中其特征始終保持。當細胞株傳至50代以后又會(huì )出現“危機”,不能再傳下去。但是有部分細胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變,并且帶有癌變的特點(diǎn),有可能在培養條件下無(wú)限制地傳代下去,這種傳代細胞稱(chēng)為細胞系。
原代培養是建立各種細胞系(株)必經(jīng)的階段,其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培養技術(shù)和方法、適宜培養基的選擇等多種因素有關(guān)。由于原代培養的細胞轉化性極小,對病毒敏感性好,因此適應制備疫苗等生物制品;但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標本、且受供體年齡健康狀況的影響而導致批間差異大等缺陷。目前常用的原代細胞培養有雞胚成纖維細胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細胞。
原代培養的基本過(guò)程包括取材、培養材料的制備、接種、加培養液、置培養條件下培養等步驟,在所有的操作過(guò)程中,都必須保持培養物及生長(cháng)環(huán)境的無(wú)菌。
多數情況下,分散的細胞若屬于貼壁依賴(lài)型細胞,就能黏附、鋪展于培養器皿和載體表面生長(cháng)而形成細胞單層,這種培養方式稱(chēng)為單層細胞培養(monolayer culture),又叫貼壁培養(adherent culture)。少數情況下,培養的細胞沒(méi)有貼壁依賴(lài)性,可通過(guò)專(zhuān)門(mén)設備使細胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長(cháng),這種形式稱(chēng)為懸浮培養(suspension culture)。如何讓接種的細胞盡快貼壁,是決定培養成功的關(guān)鍵步驟:
取決于適當的生長(cháng)基質(zhì)表面;
可降低接種后培養液對細胞的浮力,如先少補加少量培養液,待細胞貼壁后再補足營(yíng)養液繼續培養;
注意適當的細胞接種密度,一般105個(gè)/ml左右。
五、傳代培養:當原代培養成功以后,隨著(zhù)培養時(shí)間的延長(cháng)和細胞不斷分裂,一則細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制,生長(cháng)速度減慢甚至停止;另一方面也會(huì )因營(yíng)養物不足和代謝物積累而不利于生長(cháng)或發(fā)生中毒。此時(shí)就需要將培養物分割成小的部分,重新接種到另外的培養器皿(瓶)內,再進(jìn)行培養。這個(gè)過(guò)程就稱(chēng)為傳代(passage)或者再培養(subculture)。對單層培養而言,80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。
體外培養技術(shù)中所謂的傳“代”概念并不等于細胞生物學(xué)中“親代細胞”與“子代細胞”中“代”的概念。傳代培養的實(shí)質(zhì)就是分割后再一次培養,可以相對地衡量培養物的培養年齡。
六、生長(cháng)曲線(xiàn):細胞接種入培養瓶后,先進(jìn)入2-24h的延遲期(lag period),然后進(jìn)入指數生長(cháng)期(即對數期)(log phase),匯合成單層進(jìn)入緩慢生長(cháng)或停滯期(即平臺期)(plateau lhase)。每種細胞系(cell line)的這些生長(cháng)期(growth phase)都是特征性的,只要環(huán)境條件保持恒定,每一次測定結果應該是可重復的。
第二節 細胞分離技術(shù)
一、從原代組織中分離細胞 將組織塊分離(散)成細胞懸液的方法有多種,最常用的是機械解離細胞法、酶學(xué)解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。
從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時(shí)間要盡可能的短,以保持最大的活性。下列步驟可以解聚整個(gè)組織,獲得較高產(chǎn)量的有活性細胞。
1、胰蛋白酶 (Trypsin)
在去除不需要的組織后,使用無(wú)菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4mm小片,通過(guò)懸浮在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復清洗2到3次。
將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶(100mg組織加入1ml 胰蛋白酶)。
在4℃孵育6到18小時(shí),使幾乎沒(méi)有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。
移棄組織碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。
在組織碎片加入熱的完全培養基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無(wú)血清培養基,要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)(100~200mm)過(guò)濾,分散所有剩余組織。計數和接種細胞,進(jìn)行培養。
2、膠原酶 (Collagenase)
用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。
加入膠原酶(50~200單位/ml,溶解在HBSS中)。
在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。
通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。
通過(guò)離心在HBSS中清洗懸液幾次。
再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進(jìn)行培養。
3、Dispase
用無(wú)菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片,用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。加入Dispase(0.6~2.4單位/ml 溶解在無(wú)鈣鎂的平衡鹽溶液)在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。
通過(guò)無(wú)菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過(guò)濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。通過(guò)離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進(jìn)行培養。
二、從原培養容器中分離細胞:以下是從基層迅速分離細胞,且保持細胞完整性的一般步驟。這一步驟并不意味著(zhù)對于所有細胞系的廣泛應用,每一種系統最佳條件和施用濃度應該根據經(jīng)驗加以確定。再次培養時(shí)檢測細胞的活性。細胞的活率應該超過(guò)90%對于無(wú)血清培養基,降低胰蛋白酶使用量。
1、移棄使用過(guò)的細胞培養基。
2、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸.)清洗細胞(看表確定正確的清洗溶液)。在培養瓶對著(zhù)細胞的一面加入清洗溶液,通過(guò)轉動(dòng)培養瓶1到2分鐘清洗細胞層,然后去除清洗液。
3、以2~3ml/25cm2的量,加選擇的分離液(見(jiàn)表)到培養瓶對著(zhù)細胞的一面。確保分離液覆蓋細胞層。在37℃孵育培養瓶,輕輕搖動(dòng)培養瓶。通常,在5到15分鐘內,細胞就會(huì )脫落。細胞分離需要的時(shí)間因細胞系不同而有所變化。仔細監測細胞分離過(guò)程,避免細胞受損傷。對難于從培養瓶基層分離的細胞系,可以輕輕敲打,以加速分離過(guò)程。
4、當細胞完全分離時(shí),垂直放置培養瓶,讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入完全培養基,通過(guò)移液管在單層細胞表面反復吹打來(lái)分散細胞。計數并再次培養細胞。
5、對于無(wú)血清培養基,加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。
第三節 細胞的凍存與復蘇
為了防止因污染或技術(shù)原因使長(cháng)期培養功虧一簣,考慮到培養細胞因傳代而遲早會(huì )出現變異,有時(shí)因寄贈、交換和購買(mǎi),培養細胞從一個(gè)實(shí)驗室轉運到另一個(gè)實(shí)驗室,最佳的策略是進(jìn)行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要?,F簡(jiǎn)要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點(diǎn)。細胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時(shí),細胞內的酶活性均己停止,即代謝處于完全停止狀態(tài),故可以長(cháng)期保存。細胞低溫保存的關(guān)鍵,在于通過(guò)0~20℃階段的處理過(guò)程。在此溫度范圍內,水晶呈針狀,極易招致細胞的嚴重損傷。
一、細胞的凍存:為避免污染造成的損失,最小化連續細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉化,需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前,細胞應該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養基用來(lái)凍存細胞。對于包含有血清的培養基,成分可能如下:
包含10%甘油的完全培養基,
包含10%二甲基亞砜(DMSO)的完全培養基,
50% 細胞條件培養基和50%含有10%甘油的新鮮培養基,或
50% 細胞條件培養基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養基。
對于無(wú)血清培養基,一些普通的培養基成分可能是:
50% 細胞條件無(wú)血清培養基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無(wú)血清培養基,或
包含有7.5%二甲基亞砜和10%細胞培養級BSA的新鮮無(wú)血清培養基。
1、懸浮細胞
計數將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數生長(cháng)期。以大約200~400g離心5分鐘沉淀細胞,使用移液管移去上清到最小體積,不要攪亂細胞。
以1×107到5×107細胞/ml密度,在包含有血清的冷凍培養基中再次懸浮細胞,或者以0.5×107到1×1027在無(wú)血清培養基中,再次懸浮細胞。
分裝進(jìn)凍存管,將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內開(kāi)始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍,可以通過(guò)可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉移到液氮中貯存。
2、貼壁細胞
使用分離試劑從基層分離細胞,分離時(shí)盡可能溫和,使對細胞的損傷減少到最小。
在完全生長(cháng)培養基中,再次懸浮分離細胞,確定有活力細胞數。
以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到最小體積,不要攪亂細胞。
以5×106到1×106細胞/ml密度,在凍存液中懸浮細胞。
分裝進(jìn)凍存管,將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內開(kāi)始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍,可以通過(guò)可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉移到液氮中貯存。
二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱,要輕柔操作。凍存細胞要快速融化,并直接加入完全生長(cháng)培養基中。若細胞對凍存劑(DMSO或甘油)敏感,離心去除凍存培養基,然后加入完全生長(cháng)培養基中。
1、直接鋪板方法
取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
直接用完全生長(cháng)培養基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml完全生長(cháng)培養基。進(jìn)行活細胞計數,細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。培養細胞12到24小時(shí),更換新鮮的完全生長(cháng)培養基,去除凍存劑。
2、離心方法
取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml完全生長(cháng)培養基,輕輕混勻。
以大約80x g離心2到3分鐘。
棄去上清。
在完全生長(cháng)培養基輕輕再次懸浮細胞,并且進(jìn)行活細胞計數。
細胞鋪板,細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。
三、細胞的分化、衰老與死亡
1、細胞的分化:一個(gè)成年人全身細胞總數約1012個(gè),可以區分為200多種不同類(lèi)型的細胞:形態(tài)結構,代謝,行為,功能等各不相同。追根溯源,這么多種細胞均來(lái)自一個(gè)受精卵細胞。所以,通常把發(fā)育過(guò)程中,細胞后代在形態(tài)、結構和功能上發(fā)生差異的過(guò)程稱(chēng)為細胞分化。細胞分化發(fā)生在胚胎階段,也發(fā)生在胎兒出生以后,乃至成人階段。例如,人體血細胞的產(chǎn)生和分化,這個(gè)過(guò)程在人的一生中一直持續著(zhù)。
由旺盛生長(cháng)不斷分裂的細胞,轉入分化,通常從細胞周期中G1期開(kāi)始時(shí)一個(gè)確定的點(diǎn)G0點(diǎn)“逃逸”出細胞周期。旺盛生長(cháng)分裂的細胞和各種分化了的細胞,它們的基因表達和代謝活動(dòng)各不相同。
2、細胞的衰老:體外細胞培養實(shí)驗證明:
成纖維細胞:來(lái)自胎兒傳代50次后衰老死亡,來(lái)自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來(lái)自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來(lái)自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。
細胞衰老過(guò)程中會(huì )發(fā)生一系列的變化,包括:蛋白質(zhì)合成速度降低,已有蛋白質(zhì)結構變化,特異蛋白質(zhì)成份出現;同時(shí),細胞核,線(xiàn)粒體,膜系統、骨架系統等都有結構、功能的改變。
細胞衰老原因,尚無(wú)定論,出現過(guò)好幾種理論與假說(shuō),其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說(shuō)”。
3、細胞凋亡:細胞的死亡是個(gè)體存活的正?,F象,常見(jiàn)的細胞死亡形式有3種:壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動(dòng)中,因為環(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵,導致一部分細胞死去,稱(chēng)為細胞的病理死亡,或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學(xué)刺激時(shí)導致的細胞死亡;細胞毒性是由細胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細胞殺傷事件,不依賴(lài)于其它兩種細胞死亡機理,如殺傷T細胞的細胞毒性作用。
還有一種情況,一部分細胞的死亡是生物個(gè)體正常生命活動(dòng)(代謝、生長(cháng)、發(fā)育、分化)的一個(gè)必要部分;似乎帶有“犧牲局部,保全整體”的意味。這種情況下的細胞死亡,明顯地受遺傳控制,稱(chēng)為細胞凋亡。 凋亡(Apoptosis)則是程序性的、正常的細胞死亡,是機體清除無(wú)用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個(gè)截然不同的過(guò)程,無(wú)論從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)還是生化的特征來(lái)說(shuō),都有明顯的區別。細胞凋亡現象普遍存在于生物界。細胞凋亡與細胞增殖、分化和衰老起著(zhù)互補與平衡的作用,在多細胞動(dòng)物的發(fā)育、形態(tài)建成與維持中扮演至關(guān)重要的角色。作為細胞的一種基本生命現象,凋亡失控的結果將是可怕的:凋亡不足時(shí),易發(fā)生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾??;而凋亡過(guò)量則可能產(chǎn)生獲得性免疫缺陷綜合征(HIV)、重癥肝炎與退行性神經(jīng)疾病,如老年性癡呆癥(Alzheimer's disease)、帕金森氏癥(Parkinson's disease)。因此研究細胞凋亡及其機理具有重要的理論和實(shí)踐意義。
細胞凋亡與壞死的區別
壞死 :
形態(tài)學(xué)特征-膜完整性喪失,胞漿和線(xiàn)粒體膨脹,全細胞裂解。
生化特征-離子內環(huán)境失調:非能量依賴(lài)性的(被動(dòng)過(guò)程,在4°C也可以發(fā)生),隨機消化DNA(電泳顯示為DNA彌散狀態(tài)),Postlytic DNA斷裂。
生理學(xué)特征-影響群組細胞:由非生理學(xué)因素引起(如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等),被巨噬細胞吞噬,周?chē)忻黠@的炎癥反應。
凋亡 :
形態(tài)學(xué)特征-胞膜出芽,但保持完整,染色體聚集在核膜周邊,胞漿收縮、細胞核凝集,最后細胞分裂為凋亡小體,Bcl-2家族蛋白導致線(xiàn)粒體膜通透性增加。
生化特征--ATP依賴(lài)性的(主動(dòng)過(guò)程,在4°C不能發(fā)生),以核小體為單位剪切DNA(電泳顯示為DNA ladder),Prelytic DNA 斷裂,線(xiàn)粒體釋放多種因子至胞漿中(細胞色素c、AIF),Caspases級聯(lián)活化,膜對稱(chēng)性改變(PS外翻)
生理學(xué)特征--只影響單個(gè)細胞,由生理學(xué)刺激誘導(如生長(cháng)因子缺乏、激素環(huán)境改變等),被臨近細胞和巨噬細胞吞噬,無(wú)炎癥反應。
第四節 細胞計數及活力測定
一、原理 培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(cháng)良好,所以要進(jìn)行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。
在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞,總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力,由組織中分離細胞一般也要檢查活力,以了解分離的過(guò)程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力,了解凍存和復蘇的效果。
用臺盼蘭染細胞,死細胞著(zhù)色,活細胞不著(zhù)色,從而可以區分死細胞與活細胞。利用細胞內某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應,也可測定細胞相對數和相對活力。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器與用品:普通顯微鏡、血球計數板、試管、吸管、酶標儀(或分光光度計)
2、試劑:0.4%臺盼蘭,0.5%四甲基偶氮唑鹽(MTT)、酸化異丙醇
3、材料:細胞懸液
三、操作步驟
(一)細胞計數
1、將血球計數板及蓋片用擦試干凈,并將蓋片蓋在計數板上。
2、將細胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿(mǎn)蓋片和計數板之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀(guān)察,計算計數板四大格細胞總數,壓線(xiàn)細胞只計左側和上方的。然后按下式計算:
細胞數/ml=4大格細胞總數/ 4×10000
注意:鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細胞組成的細胞團,應按單個(gè)細胞計算,若細胞團占10%以上,說(shuō)明分散不好,需重新制備細胞懸液。
(二)細胞活力
1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。
2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液,染色2一3分鐘。
3、吸取少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片。
4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計死細胞和活細胞數,計細胞活力。
死細胞能被臺盼蘭染上色,鏡下可見(jiàn)深蘭色的細胞,活細胞不被染色,鏡下呈無(wú)色透明狀。
活力測定可以和細胞計數合起來(lái)進(jìn)行,但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。
(三)MTT法測細胞相對數和相對活力
活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周?chē)?。其量與細胞數呈正比,也與細胞活力呈正比。
l、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘,棄上清液。
2、沉淀加入0.5-1ml MTT,吹打成懸液。
3、37℃下保溫2小時(shí)。
4、加入4—5 ml酸化異丙醇(定容)。打勻。
5、1000 rpm離心,取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色,酸化異丙醇調零點(diǎn)。
注意:MTT法只能測定細胞相對數和相對活力,不能測定細胞絕對數。
第五節 細胞的分裂指數
一、原理:體外培養細胞生長(cháng)、分裂繁殖的能力,可用分裂指數來(lái)表示。它與生長(cháng)曲線(xiàn)有一定的聯(lián)系,如隨著(zhù)分裂指數的不斷提高,細胞也就進(jìn)入了指數生長(cháng)期。分裂指數指細胞群體中分裂細胞所占的百分比,它是測定細胞周期的一個(gè)重要指標,也是不同實(shí)驗研究選擇細胞的重要依據。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器與用品:CO2培養箱、普通顯微鏡、細胞培養血、蓋玻片、吸管
2、試劑:培養液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液
三、操作步驟
1、消化細胞,將細胞懸液接至內含蓋玻片的培養皿中。
2、CO2培養箱中培養48小時(shí),使細胞長(cháng)在蓋片上。
3、取出蓋片,按下列順序操作:
PBS漂洗3分鐘→甲醇:冰醋酸=3:1固定液中固定30分鐘→Giemsa液染色10分鐘→自來(lái)水沖洗。
4、蓋片晾干后反扣在載玻片上,鏡檢。
5、計算:
分裂指數=分裂細胞數/總細胞數×100%
四、注意事項;操作時(shí)動(dòng)作要輕,以免使蓋片上的細胞脫落。
第六節 細胞周期的測定
一、原理:細胞周期指細胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個(gè)周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。
單個(gè)細胞的周期測定可采用縮時(shí)攝影的方法,但它不能代表細胞群體的周期,故現多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多,有同位素標記法、細胞計數法等,這里介紹一種利用BrdU滲入測定細胞周期的方法。
BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)加入培養基后,可做為細胞DNA復制的原料,經(jīng)過(guò)兩個(gè)細胞周期后,細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2,反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期,則染色體中約一半為兩條單體均淺染,另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期,則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例,就可算出細胞周期的值。
二、儀器、用品與試劑
1、儀器、用品:同常規細胞培養
2、試劑:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液
三、操作步驟
1、細胞生長(cháng)至指數期時(shí),向培養液中加入BrdU,使最終濃度為10μg/ml。
2、44小時(shí)加秋水仙素,使每ml中含0.1μg。
3、48小時(shí)后常規消化細胞至離心管中,注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。
4、常規染色體制片(見(jiàn)第三部分:染色體技術(shù))。
5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上,鋪上2×SSC 液,距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
6、棄去2×SSC液,流水沖洗。
7、Giemsa液染色10分鐘,流水沖洗,晾干。
8、鏡檢100個(gè)分裂相,計第一、二、三、四細胞期分裂指數。
9、計算:
細胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小時(shí))
第七節 培養物的污染及防止
按現代的觀(guān)念,凡是混入培養環(huán)境中對細胞生存產(chǎn)生有害的成分和造成細胞不純的異物都應該視為污染。根據這一概念,組織培養污染物應包括生物(真菌、細菌、病毒和支原體)、化學(xué)物質(zhì)(影響細胞生存、非細胞所需的化學(xué)成分)、細胞(非同種的其他細胞)。其中一微生物最為多見(jiàn)。另外,隨著(zhù)使用細胞種類(lèi)增多,不同細胞交叉污染,尤其是Hela細胞的污染也時(shí)有發(fā)生,從而造成細胞不純。
一、污染途徑 污染物,特別是微生物常通過(guò)下列途徑進(jìn)入培養體系,造成污染
1、空氣:空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑??諝饬鲃?dòng)性大,如果培養操作場(chǎng)地于外界隔離不嚴格或消毒不充分,外界不潔空氣很容易進(jìn)入造成污染。因此,培養設施不能設在通風(fēng)場(chǎng)所。無(wú)菌操作應在凈化臺內進(jìn)行,工作時(shí)要帶口罩,以免因講話(huà)、咳嗽等使外界污染進(jìn)入操作面,造成污染。
2、器材:各種培養器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導致污染,另外需要對培養箱進(jìn)行定期消毒,防止形成污染
3、操作:實(shí)驗操作無(wú)菌觀(guān)念不強,技術(shù)不熟練,使用污染的器皿或封瓶不嚴等,都可以造成污染。培養兩種細胞以上時(shí),操作不規范,交叉使用吸管或培養液、瓶等有可能導致細胞交叉污染。
4、血清:有些血清在生產(chǎn)時(shí)就已經(jīng)被支原體或病毒等污染,變成了污染。
5、組織樣本:原代培養的污染多數來(lái)源于組織樣本;取材時(shí)碘酒消毒后脫碘不徹底,可造成碘混入組織,細胞或培養液中,影響細胞細胞生長(cháng)。
二、污染對培養細胞的影響及污染的檢測
由于體外培養細胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力,而且培養基中的抗生素抗污染能力有限,因而培養細胞一旦發(fā)生污染多數將無(wú)法挽回。細胞污染早期或污染程度較輕時(shí),如果能及時(shí)去除污染物,部分細胞有可能恢復、但是當污染物持續存在培養環(huán)境中,輕者細胞生長(cháng)緩慢,分類(lèi)象減少,細胞變得粗糙,輪廓增強細胞漿出現顆粒、污染較嚴重,細胞增值停止,分裂象消失,細胞質(zhì)中出現大量堆積物,細胞變圓、脫壁。
(一)細菌污染對培養細胞的影響及污染物的檢測
常見(jiàn)的污染細菌有大腸桿菌、假單孢菌、葡萄球菌等。細菌污染初期由于培養體系的抗生素作用, 其繁殖處于抑制狀態(tài),細胞生長(cháng)不受明顯影響,污染情況用倒置顯微鏡觀(guān)察不易判斷。懷疑培養細胞有細菌污染時(shí),取10ml細胞懸液離心1000轉5分鐘,沉淀中加入無(wú)抗生素培養液2ml,將細胞放培養箱培養。
如果培養無(wú)真的細菌污染,24小時(shí)內可以獲得陽(yáng)性結果。當污染的細菌量比較大或者細菌增殖到一定基數時(shí),大約每20分鐘一代,會(huì )使培養系統中很快產(chǎn)生大量細菌,后者不僅可以消耗培養系統中的養分,還能釋放大量代謝產(chǎn)物。幾個(gè)小時(shí)后,增殖的細菌就可以導致培養液外觀(guān)渾濁,肉眼就可以判斷。細菌污染大多數可以改變培養液pH,使培養液變渾濁、變色。用相差顯微鏡觀(guān)察,可見(jiàn)滿(mǎn)視野都是點(diǎn)狀的細菌顆粒,原來(lái)的清晰培養背景變得模糊,大量的細菌甚至可以覆蓋細胞,對細胞的生存構成威脅。用青霉素、鏈霉素可以預防細菌污染有效。
(二)真菌污染對細胞的影響及污染物的檢測
微生物污染中以真菌最多,真菌種類(lèi)繁多,形態(tài)各異,但是污染后易于發(fā)現,大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養液表面,肉眼可見(jiàn);有的散在生長(cháng),鏡下可見(jiàn)呈絲狀、管狀、樹(shù)枝狀,縱橫交錯穿行于細胞之間。念珠菌和酵母菌卵圓形,散在細胞周邊和細胞之間生長(cháng)。真菌生長(cháng)迅速,能在短時(shí)間內抑制細胞生長(cháng)、產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺死細胞??拐婢苿︻A防和排除真菌污染有效。
(三)支原體污染對細胞影響及污染物的檢測
細胞培養(特別是傳代細胞)被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題,是細胞培養最常見(jiàn)的、干擾試驗結果的一種污染。但由于不易被察覺(jué),有些污染的細胞仍在被應用。研究表明,95%以上是以下四種:口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體(M.arginini)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)和萊氏無(wú)膽甾原體(A.laidlawii),為牛源性。以上是最常見(jiàn)的污染細胞培養的支原體菌群,但能夠污染細胞的支原體種類(lèi)是很多的,國外調查證明,大約有二十多種支原體能污染細胞,有的細胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。據查,目前各實(shí)驗室使用的二倍體細胞和傳代細胞中約有11%的細胞受到支原體污染。
污染來(lái)源包括工作環(huán)境污染、操作者本身污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養基污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實(shí)驗器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細胞的原始組織或器官的污染。支原體污染后,因為它們不會(huì )使細胞死亡可以與細胞長(cháng)期共存,培養基一般不發(fā)生渾濁,細胞無(wú)明顯變化,外觀(guān)上給人以正常感覺(jué),實(shí)則細胞手到多方面潛在影響,如引起細胞變形,影響DNA合成,抑制細胞生長(cháng)等。
細胞培養中,主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預防支原體的污染:控制環(huán)境污染;嚴格實(shí)驗操作;細胞培養基和器材要保證無(wú)菌;在細胞培養基中加入適量的抗生素。
支原體污染細胞后,特別是重要的細胞株,有必要清除支原體,常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體最突出的結構特征是沒(méi)有細胞壁,一般來(lái)講,對作用于細胞壁生物合成的抗生素,如 -內酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等完全不敏感;對多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)內酯類(lèi)及一些氟喹諾酮;其他類(lèi)抗生素如氨基糖苷類(lèi)、氯霉素對支原體有較小抑制作用,所以常不用來(lái)作為支原體感染的化學(xué)治療劑。
(四)細胞交叉污染對細胞的影響及污染物的檢測
細胞培養中,細胞間交叉污染并不罕見(jiàn),多是由于在培養中操作時(shí)各種細胞同時(shí)進(jìn)行,混雜使用器皿和液體所致,這種污染能使細胞的生長(cháng)特性、形態(tài)特征等發(fā)生變化,有些變化較輕、不易察覺(jué),有些可能由于污染的細胞具有生長(cháng)優(yōu)勢最終壓過(guò)原來(lái)細胞而導致細胞的生長(cháng)抑制,最終死亡。常用觀(guān)察細胞形態(tài)學(xué)、分析生長(cháng)特性和核型、檢測細胞的標記物等方法檢測交叉污染的細胞。
三、污染的預防:防止污染,預防是關(guān)鍵,預防措施應該貫穿整個(gè)細胞培養的始終。



文章來(lái)源:丁香通


文章分類(lèi): 行業(yè)新聞
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